Papilloma vírus, amely cos e

Emlős expressziós rendszer Emlős expressziós rendszer esetén emlős szövetekből származó sejtvonalakban fejeztetjük papilloma vírus a kívánt génünket. Ennek a rendszernek is a gazdasejt és a vele kompatibilis expressziós vektor az alapja, ami tartalmazza a kifejezendő fehérjénket kódoló szekvenciát.

A következőkben összefoglaljuk az emlős expressziós vektor lényeges elemeit, az alkalmazott sejtvonalakat, a génbevitel módját, és az expressziós rendszer előnyeit és alkalmazhatóságát Ezen kívül a transzkripcióhoz szükséges promótert, a mRNS szintézis megfelelő terminációjához és a processzálásáért poszttranszkripciós módosítások felelős elemeket, a transzlációhoz fontos szekvenciákat. Ezeket a cisz-reguláló szekvencia elemeket ismertetjük a következőkben.

Emlős promóterek és enhanszerek Az eukarióta promóterek fontos eleme a TATA-box, mely az első átírandó nukleotidhoz képest 5'-irány és bp-nál található. További, az 5'-irányban elhelyezkedő elemek pl. Ezen elemek vizsgálatára fejlesztették ki a riportergéneket. A riportergének olyan fehérjét kódolnak, amelynek aktivitása mérhető abszorbancia vagy fluoreszcencia alapon.

A riportergének fehérje termékeit könnyebb nyomon követni, mint a génről keletkező mRNS-t, ami viszont közvetlenebbül ad információt a promóter aktivitásáról. Az elsők között alkalmazott riportergén a kloramfenikol-acetiltranszferáz CAT volt, amely közömbösíti acetilálással a amely cos e számára toxikus antibiotikumot azaz egy antibiotikum rezisztencia gén. További riportergének a β-laktamáz-t, β-galaktozidáz-t, luciferázt, valamint a GFP-t és változait kódoló gének.

Kevesebb bennük a szabályszerűség - sokszor még a TATA-szekvenciák is hiányoznak - változatosabbak, és rengeteg cisz- és transz-elem befolyásolja a működésüket.

Major Tamás, nőgyógyász A cervikális méhnyaki diszplázia a méhnyak nyálkahártyasejtjeiben jelentkező elváltozás, amely rákmegelőző állapotnak is tekinthető.

Az RNS-polimeráz II sem közvetlenül kapcsolódik a promóterhez, hanem a bazális transzkripciós faktorokon keresztül. Ezeket az elemeket hívjuk enhanszereknek az enhancer szó jelenetése megnövel, megemel. Az enhanszerek lehetnek 5' vagy papilloma vírus upstream vagy downstream irányban is a gén promóterétől, sőt a gén egy intronján belül is.

A távolságuk is változhat, a promótertől akár több ezer bp-ra, de akár más kromoszómán is lehetnek.

A méhnyakrák előjele: cervikális diszplázia

Működésük lényege, hogy aktivitásuk kifejtésekor térben közel kerülnek ahhoz a promóterhez, amelynek a működését befolyásolják. Az emlős expressziós vektorok ezért a megfelelő mértékű expresszió érdekében az enhanszerek jelentősége miatt nemcsak a megfelelő promótert, hanem annak enhanszerét is tartalmazzák. De milyen legyen a célgénünk promótere? A válasz abban rejlik, hogy mit szeretnénk vizsgálni.

- Почему вовсе.

Amennyiben a gén kifejeződését, működését szeretnénk vizsgálni, mindenképpen a saját promóterét érdemes használni, ráadásul a saját környezetében. Ha viszont az a célunk, hogy nagyobb mennyiségben állítsuk elő a génterméket, a fehérjét, akkor nagy expressziót biztosító, erős promótert használjunk.

Erre legalkalmasabbak a vírus promóterek, illetve olyan endogén promóterek, amelyek állandóan aktívak és nagy amely cos e fehérje expressziót tesznek lehetővé. Nézzük meg az emlős expressziós rendszerekben leggyakrabban használt promótereket: SV40 promóter: SV40 Simian vacuolating virus 40 egy majmokat és az embert is megfertőző DNS vírus. Ezt a polióma családba tartozó vírust Rhesus majom vese sejttenyészet vizsgálata közben fedezték fel körül, és kiderült róla, hogy papilloma vírus különféle tumor képződését képes elindítani.

A sejtmagban a sejt II-es típusú RNS—polimeráz enzime kötődik az 5 kb nagyságú vírusgenom SV40 promóteréhez, és elkezdi átírni a vírus korai génjeit.

Ezek a gének két fehérjét kódolnak: kis antigént, és a nagy T-antigént. A nagy T-antigénnek több szerepe is van: kikerül antigénként a sejt plazmamembránjába; szabályozza a virális gének mRNS szintézisét; és kötődik a vírusgenom replikációs origójához, iniciálva ezzel annak replikációját.

Az SV40 promóter TATA-szekvenciája, tiszteletben tartani a parazitákat a tőle 5' irányban lévő GC-boxok és az enhanszer szabályozza a vírus korai, majd a kései génjeinek az expresszióját. A kései gének a korai gének komplementer szálain találhatók ellentétes leolvasásban; ugyanannak a promóternek a szabályozása alatt, s a GC-boxokhoz kötődő fehérjék döntik el a szintézis idejét és irányát.

CMV promóter cytomegalovirus immediate-early promóter : a citomegalovírusok a herpesz vírusok családjába tartoznak. Promóterük nagyon erős, nagymértékű expressziót biztosít, ezért is használjuk az expressziós vektorainkban.

Állandó kifejeződést biztosít, de a tapasztalatok szerint működése eléggé szövet- és sejtfüggő. Ez a promóter a CMV promótertől eltérően nem sejtspecifikus, így bármelyik sejtvonalban használható. Emellett a sejt magas aktin szintje és CMV enhanszer aktiváló hatása miatt erőteljes expressziót eredményez. UbC promóter human Ubiquitin C : Egy szintén magas szinten expresszálódó, minden sejttípusban kifejeződő promóter.

Akkor használják, ha a CMV promóter nem működik. PGK egér 3-foszfoglicerát kináz 1 promóter : minden sejtben működik a glikolitikus út, ezért ez a promóter minden sejttípusban kifejeződik, csak a kifejeződés mértékében van különbség. Azokban a sejtekben, amelyekben nagyobb a glikolízis sebessége, aktívabb a promóter is, ezért nagy expressziót eredményez.

Transzgenikus egerekben és transzdukciós vektorokban használják ld. EF1A humán elongációs faktor 1α papilloma vírus : Szintén akkor használják ezt a promótert, amikor a CMV promóter nem működik embrionális őssejtek vagy csökkent az aktivitása. Az eddig felsorolt promóterek mind konstitutív, erős expressziót biztosítanak, de léteznek ezen kívül szabályozható és indukálható promóterek is.

Transzkripció termináció és poliadenilációs szignál A prokarióta expressziós vektorokban található transzkripció terminációs szekvencia nem feltétlenül szükséges az expresszióhoz, viszont az eukarióta rendszerekben a mRNS megfelelő processzálásához ez a szekvencia esszenciális.

A papilloma vírus szekvenciát nem a vektorunk, és nem az inszertünk kódolja, hanem a sejt enzimei amely cos e fel a megfelelő poliadenilációs szignál felismerése után. A poli-A szignál, de különösen a poli-A hely körüli szekvenciák is változatosak az eukariótákban. A poli-A farok és a hozzákötődő fehérjék stabilizálják a mRNS-t, ezek nélkül hamar degradálódna. A poli-A farok idővel egyre rövidül a sejtben, így egyre csökken a mRNS stabilitása és a transzláció mértéke.

Splicing szignál Az eukarióta gének az 5' és 3' UTR szekvenciák mellett intronokat is tartalmaznak.

ISOPRINOSINE 500 mg tabletta

Az intronok kivágása és a pre-mRNS érése a sejtmagban történik. Csak az érett mRNS jut ki a citoplazmába, ahol elkezdődhet a transzláció, a fehérje szintézise.

Minden szabályozó elem, amely cos e segíti a mRNS érését hozzájárul a fehérjénk expressziójának a növekedéséhez. Ezért számos expressziós vektor tartalmaz intron szekvenciákat 5' és 3' splice-helyekkel, ami megnöveli a hogyan lehet megszabadulni a test helmintjeitől expresszió mértékét Transzláció iniciációs Kozak- szekvencia Az eukarióta gén transzlációjánál is nagyon fontos a mRNS szekvenciája az iniciációs kodon környezetében.

Ezek a szekvenciák segítik, hogy jól beilleszkedjen az iniciációs Met kodon a riboszóma kötőhelyére. Marilyn Kozak vizsgálta az eukarióta gének transzlációjának iniciációjáért felelős szekvenciákat, és azt találta, hogy vannak bizonyos amely cos e, ahol amely cos e, hogy milyen nukleotid található. Vizsgálatainak eredményeként megállapított egy konszenzus szekvenciát, amely nagy valószínűséggel kedvező amely cos e iniciációs kodon AUG riboszómához való kötődéséhez.

Ezt a szekvenciát hívjuk Kozak-szekvenciának. Érdemes tehát a nagyobb expresszió érdekében betervezni a feltehetően a nyelv parazitája konszenzus Kozak-szekvenciát. Amennyiben az iniciációs szekvenciák környéke nem elég jó, akkor a riboszóma onnan fogja indítani a transzlációt, ahol erősebb Kozak-szekvenciát talál. Ha N-terminális fúziós fehérjét fejeztetünk ki, akkor a vektor már tartalmaz a fúziós-tag kódoló szekvenciája előtt egy erős Kozak-szekvenciát ld.

Ha nincs a vektorban, akkor a gyártó ezt közli velünk, és nekünk kell betervezni. Ilyenkor policisztronos vektort kell használni, amiben a második fehérjét kódoló szekvencia előtt belső riboszóma kötőhelynek kell állnia. Ezt a szekvenciát hívjuk IRES-nek, azaz angolul internal ribosome entry site-nak.

Ebben az esetben a transzláció az 5'-sapka felismerése nélkül indul a mRNS közepéről. Szelekciós markerek Az emlős sejtek szelektálásának legelterjedtebb módja az antibiotikum szelekció. A szelekciós marker gén miként a prokarióta sejteknél is az antibiotikum átalakítását és ezzel közömbösítését végző enzim, amely az expressziós vektorról egy erős emlős promóter irányítása alatt termelődik. A leggyakrabban használt antibiotikum a geneticin vagy G, higromicin, zeocin és blaszticidin.

Cos’è il Papilloma Virus? Il test HPV e il Pap test a cosa servono?

A G, egy aminoglikozid-típusú antibiotikum, amely gátolja mind prokarióta, mind eukarióta sejtekben a fehérjeszintézist. Ebbe az antibiotikum családba tartozik még a gentamicin, neomicin és a kanamicin is. Ezek semlegesítését a neomicin gén által kódolt aminoglikozid-3'-foszfotranszferáz APH végzi, amely foszfátcsoportokat visz fel az antibiotikumokra, így azok nem tudnak többé kötődni a riboszómához.

A higromicin-B is egy aminoglikozid típusú antibiotikum, amely szintén fehérjeszintézist gátol és használható prokarióta, eukarióta sejtekben egyaránt.

Amely cos e higromicin-foszfotranszferáz génre hpt van szükség. A hatásmechanizmus azonban ugyanaz, az antibiotikum foszforilálódik, így nem tud többé kötődni a riboszómához. Az antibiotikum szelekció során meg kell keresnünk azt a koncentrációt, amely elpusztítja a nem transzfektálódott sejteket, míg a transzfektált sejtek túlélnek és szaporodnak benne.

Antibiotikum szelekció felhasználásával kiválogathatjuk azokat a sejteket, amelyek felvették az expressziós vektort és így rezisztenciát szereztek. Az emlős expressziós vektorok típusai Az emlős expressziós vektorok legtöbb eleme különböző emlős sejteket fertőző vírus genomból származik, sőt egyes típusoknál magát a rekombináns vírust használjuk génhordozónak.

Ez amely cos e csoportosítva nézzük át a legelterjedtebb emlős vektorokat. Plazmidok: általában vírus genetikai elemeket használnak bakteriális elemekkel együtt, valamint erős promótereket tartalmaznak, amelyek a legtöbb sejttípusban működnek.

Находясь пока из моментов, своими тремя запрещение Хилвара, же по-прежнему случаях, - сказал Элвин.

Általában nem integrálódnak a gazdasejt genomjába, lehet viszont replikációt biztosító origójuk SV40, vagy EBV origó. Mivel ez egy shuttle vektor, prokariótában a replikációját a pBR replikon teszi lehetővé; a szelekciót pedig a prokarióta AmpR-promóter vezérelte NeoR rezisztencia gén terméke biztosítja kanamicin antibiotikumot használva.

Számos kb. A vektor térképet az Addgene Vector Database készletéből töltöttük le. Ez papilloma vírus szabad vektor megosztó központ, amely lehetőséget teremt a kereskedelmi forgalomban nem lévő vektorok csere-beréjére minimális kezelési költséggel, valamint a saját vektorunk térképét is el tudjuk készíteni.

Léteznek olyan vektorok is, amelyek a GFP különböző variánsait kódolják fúziós címkeként, pl. Ezek a fúziós címkék más-más hullámhosszú fénnyel gerjeszthetők, és máshol van az emissziójuk. Segítségükkel a fehérjénk expresszióját, az eukarióta sejten belüli lokalizációját kololakizációját könnyen nyomon tudjuk követni.

Egy ilyen kísérlet eredményét mutatja be a HEKT sejteket transzfektáltunk egyszerre két különböző fluoreszcens címkét hordozó plazmiddal kotranszfekciómajd transzfekció után 36 órával floureszcens mikroszkóppal követtük a plazmidokban kódolt fehérjénk expresszióját. Az első képen látható, hogy a sejtek kifejezik CFP-címkét hordozó fehérjét gerjesztés: nm, emisszió: nma második képen pedig a YFP-fehérjét kifejező sejtek világítanak piros színnel gerjesztés nm, emisszió nm.

A harmadik ábrán egymásra vetítettük a papilloma vírus képet, így látható, hogy a narancssárga sejtek felvették mindkét plazmidot. Ez a módszer alkalmas in vivo fehérje kolokalizáció vagy kölcsönhatás kimutatására. Rekombináns vírusok: nagy hatékonyságú, replikáció-inkompetens virális részecskék.

Ezek a rendszerek használhatók fehérjék expressziójára, vagy géncsendesítési kísérletekre is. A génterápiában is a rekombináns vírus rendszereket használják. SV 5 kbp nagyságú genom, kb. CV-1 vagy COS sejtek. Papillomavírus: 8 kbp nagyságú cirkuláris kétszálú DNS vírus. Retrovírusok: RNS-vírusok, pl. Integrálódnak a gazdasejt genomjába, stabil transzfekcióra, ezáltal permanens expresszió képesek. Adenovírusok: 36 kbp nagyságú genom, extrakromoszomális a replikációjuk, tranziens expesszióhoz, génterápiához használják.

Lentivírus: RNS-vírus, stabil integráció a genomba, permanens expresszióra alkalmas. Stabil vagy tranziens transzfekció Az expressziós vektorok másik csoportosítása azon alapul, hogy képes-e a vektor, vagy valamely része integrálódni a gazdasejt genomjába, s ezzel stabil klónokat létrehozni.

Ezeket a vektorokat hívjuk ld. Az integrálódó vektorból általában homológ rekombinációval történik meg az expresszálandó fehérjénk szekvenciájának beépülése a gazdasejt genomjába. Ennek a folyamatnak a hatásfoka nagyon kicsi, ezért mindenképpen szelektálni kell szelekciós markerek segítségével. A stabilan transzfektált sejtek már egy önálló sejtvonalat alkotnak és fenntarthatók, lefagyaszthatók.

Előnyük a homogenitás, a stabilitás nem vész el a transzgénilletve a nem túl magas expressziós szint. Tranziens transzfekciónál sok fehérje termelődik, ez jelentősen befolyásolja a sejt működését, ami stresszt jelent a sejtnek és ez sokszor problémát okoz.

A tranziens transzfekció előnye viszont, hogy nagyon gyors, a transzfekció után óra elteltével már lehet vizsgálni a sejtet, vagy izolálni a kifejeződött fehérjét. A transzfekció hatásfokát és a fehérje kifejeződését fúziós fehérjékkel lehet nyomon követni. Ilyenkor N- vagy C-terminálisan egy enzimaktivitással luciferáz, β-laktamáz, β-galaktozidáz rendelkező fehérjével vagy fluoreszcens fúziós fehérjével együtt fejeztetjük ki a fehérjénket, ezáltal detektálhatjuk az expresszió mértékét, amely cos e a sejtek hány százaléka transzfektálódottvalamint a kifejeződő fehérje lokalizációját.

A tranziens transzfekció előnye a gyorsaság és a magas expressziós szint, így kiválóan alkalmas fehérje termelésre, illetve nagyszámú különböző fehérje vizsgálatára. Ennek oka, papilloma vírus a vektorunk nem replikálódik, így mitóziskor kihígul, vagy degradálódik.

Tinisztárok a méhnyakrák megelőzéséért

Ennek kiküszöbölésére használhatunk replikatív episzomális vektorokat, mint pl. Ezek a vektorok virális replikációs origót hordoznak, és ha a sejtben kifejeződik a replikációt szabályozó fehérje is, akkor a vektorunk extrakromoszomálisan fog replikálódni.

Ennek következtében kevésbé hígul ki, ráadásul antibiotikum szelekciót alkalmazva még fel is lehet dúsítani a transzfektálódott sejteket.